ARRS PROJECT

Vodja projekta: Dr. Vojč Kocman

1. VSEBINSKI OPIS PROJEKTA:

Zelo malo je znanih informacij o strukturah mitohondrijskih tRNA (mt-tRNA) kot tudi fragmentov mt-tRNA (mt-tRF). Razumevanje strukturnih podrobnosti mt-tRNA nam bo omogočilo, da na atomski ravni resolucije ugotovimo, kateri strukturni motivi so potrebni za interakcije z encimi zorenja mt-tRNA, aminoacil-tRNA sintetazami in mitohondrijskimi prevajalnimi encimi. Poleg tega bomo razumeli, na kakšen način mutacije mt-tRNA vodijo v obolela stanja. Zelo verjetno je, da mt-tRF tvorijo zapletene strukture, saj je bilo dokazano, da fragmenti jedrsko kodiranih molekul tRNA tvorijo tetramerne G-kvadruplekse, ki so biološko pomembni. Dokaz, da mt-tRF lahko tvorijo stabilne strukture, bo neposredno nakazal, da je potrebno upoštevati strukturni vidik pri razpravi o njihovi biološki funkciji in vpletenosti v bolezni ali njihovem preprečevanju.

a. osnovni podatki glede financiranja:

Projekt sofinancira ARRS s 1700 letnimi urami cenovnega razreda B za obdobje 2 let. Pričetek financiranja je 1. 10. 2021.

b. sestava projektne skupine s povezavami na SICRIS

Na Kemijskem inštitutu v projektni skupini Z1-3192 sodelujejo:
Dr. Vojč Kocman

2. FAZE PROJEKTA IN NJIHOVA REALIZACIJA

1. faza:
- sinteza in zvijanje mt-tRNA
- uporabil bom sintetizator in in vitro T7 RNA polimerazni sistem za sintezo naravno izotopsko obogatene in z različnimi shemami označevanja (2H, 13C ali 15N) obogatene mt-tRNA (mt-tRNA Ile, mt-tRNA Leu (TAA), mt-tRNA Lys, mt-tRNA Met in mt-tRNA Val)
- po potrebi bom vnesel modificirane ali izotopsko označene nukleotide na točno določena mesta v mt-tRNA molekuli s kemično sintezo na trdnem nosilcu
- konformacijska homogenost mt-tRNA vzorcev bo preverjena s pomočjo 1D 1H NMR spektrov in nativno PAGE
- spremljal bom tudi zvijanje mt-tRNA vzorcev v prisotnosti encima PRORP1
- zvitja mt-tRNA z najboljšimi NMR spektralnimi lastnostmi bodo izbrane za določitev strukture visoke ločljivosti

2. faza:
- asignacija mt-tRNA 2D 1H-1H NOESY in 1H-13C/15N HSQC spektrov
- 1H-13C/15N HSQC spektri bodo posneti na mt-tRNA molekulah, ki bodo vsebovala različno število (2H, 13C ali 15N) obogatenih ostankov in bodo omogočili asignacijo 1H resonanc. Tako bom pridobil pomembne referenčne točke za sekvenčni sprehod
- prekrivanje v 2D 1H-1H NOESY spektrih bom zmanjšal z uporabo 2H označevanja mt-tRNA
- ostanki, vključeni v bazne pare Watson-Crick, bodo identificirani s pomočjo 1H15N15N-COSY eksperimentov

3. faza:
- sinteza in groba strukturna karakterizacija fragmentov mt-tRNA
- izbrani fragmenti tRNA bodo sintetizirani s sintetizatorjem na trdnem nosilcu
- z uporabo 1D 1H NMR spektroskopije bom preveril čistost in homogenost vzorcev
- molekularnost NMR vzorcev bo določena z denaturacijsko in nativno PAGE, UV/VIS in DOSY NMR spektroskopijo
- omejitve razdalje za pridobitev strukturnega modela bodo pridobljene iz 2D 1H-1H NOESY spektrov
- za asignacijo 1H resonanc bom pripravil specifično izotopsko označene RNA (13C, 15N in 2H) na posameznem mestu in posnel 13C/15N editirane HSQC spektre

4. faza:
- določanje neizpovprečenih dipolarnih sklopitev (RDC) mt-tRNA in karakterizacija dinamike mt-tRNA z eksperimenti relaksacijske disperzije
- za RDC študije bom obravnaval mt-tRNA, ki bo imela najbolj ločene signale v 2D 1H-13C ali 15N HSQC spektrih
- molekule mt-tRNA bom poskusil usmeriti z običajnimi sredstvi za usmerjanje, kot so nitasti fagi Pf1, polietilen glikol, biceli dopirani z napolnjenimi amfifilnimi molekulami, in napolnjeni poliakrilamidni geli.
- RDC bodo določeni z asignacijo modificiranih 1H-13C ali 15N HSQC spektrov, ki kodirajo J in RDC sklopitve
- na 13C/15N označeni mt-tRNA bom izvedel eksperimente relaksacijske disperzije R1ρ (13C) in R1ρ (15N).

5. faza:
- za izdelavo strukturnih modelov z uporabo protokola simulacij počasnega ohlajanja s programsko opremo Amber bom uporabil strukturne informacije, pridobljene z NMR, v obliki omejitev razdalje, torzijskih kotov, konformacije sladkorjev in poznavanja geometrije baznega parjenja znotraj molekule.
- potrdil bom in še izboljšal strukturne modele z uporabo podatkov RDC. To je pomembno, saj v omejitvah razdalje, ki izhajajo iz NOE, običajno manjka veliko globalnih strukturnih podatkov, ki pa jih bomo pridobili s pomočjo eksperimentov RDC.
- na koncu bom poskusil pokazati, da se eksperimentalna dinamika ujema z računalniškim modelom pridobljenim s simulacijami molekulske dinamike.
- zbrane rezultate bom predstavil na simpozijih in konferencah in objavil v mednarodno uveljavljenih revijah s faktorjem vpliva.

3. BIBLIOGRAFSKE REFERENCE, KI IZHAJAJO NEPOSREDNO IZ IZVAJANJA PROJEKTA

4. LOGOTIP ARRS IN DRUGIH SOFINANCERJEV

arrs javna agencija za raziskovalno dejavnost