ARRS PROJECT

Vodja projekta: Dr. Maja Marušič

1. VSEBINSKI OPIS PROJEKTA:

Molekule morajo pri opravljanju svoje funkcije ali zvijanju v aktivno obliko zavzeti različne strukture. Bolj podrobni opisi makromolekul v delovanju ter njihovih procesov zvijanja kažejo, da makromolekule tvorijo dinamični nabor struktur ter da so nizko zasedena in visokoenergijska stanja v naboru struktur tista, ki predstavljajo aktivno funkcionalno stanje. Strukturna razlika med stanji v naboru struktur je lahko majhna, npr. na ravni odpiranja baznega para, ali pa vključuje reorganizacijo celotne makromolekule. Brez podrobnega znanja o dinamiki makromolekul je tako razumevanje njihove biološke vloge, interakcij in nadzora nepopolno ali celo napačno. NMR metode za določevanje dinamike so se izkazale kot odlične pri dopolnjevanju manjkajočih delov pri razumevanju dinamičnih procesov. Prednost NMR metod je v tem, da se jih lahko uporablja za določevanje dinamičnih procesov, ki se dogajajo v različnih časovnih okvirih od nanosekund pa do ur, ter da ponujajo informacijo o strukturi v obliki kemijskih premikov atomov alternativnih konformerov. Poleg tega lahko z NMR metodami za določanje relaksacijske dinamike zaznamo izredno nizko zasedena, visokoenergijska stanja, ki so sprožilci funkcionalnih strukturnih sprememb ali zvijanja. Z NMR metodami želimo preučevati dinamične procese štirivijačnih DNA struktur – G-kvadrupleksov, ki se tvorijo v z gvanini bogatih regijah genoma ter vplivajo med drugim na podvajanje, prepisovanje, izražanje genov in podaljševanje telomer. Podrobne raziskave G-kvadrupleksov v zadnjih letih so pokazale, da so izredno polimorfni ter da so njihova dinamična ravnotežja verjetno vitalni del njihove funkcije. Z NMR metodami za določenje dinamike bomo povezali hitre premike strukturnih elementov G-kvadrupleksov z večjimi strukturnimi spremembami med zvijanjem, polimerizacijo ter vezavo na druge molekule. Določili bomo vpliv alternativnih konformerov G-kvadrupleksnega nabora struktur na zvijanje, vezavo proteinov ter hitrost in obseg dimerizacije s testi vezave proteinov ter in vitro transkripcijo za določitev encimatske aktivnosti na z gvanini bogati DNA matrici. Razvili bomo metode za pripravo različnih izotopsko označenih oligonkleotidov ter prilagodili NMR metode relaksacijske disperzije za štirivijačne strukture DNA.

c-myb

a. osnovni podatki glede financiranja:

Projekt sofinancira ARRS s 1700 letnimi urami cenovnega razreda B za obdobje 2 let. Pričetek financiranja je 1. 9. 2020.

b. sestava projektne skupine s povezavami na SICRIS

Na Kemijskem inštitutu v projektni skupini Z1-2636 sodelujejo:
Dr. Maja Marušič

2. FAZE PROJEKTA IN NJIHOVA REALIZACIJA

1. faza:
- izbor telomernih sekvenc ter c-MYB zaporedij z različnih številom GGA ponovitev
- sinteza oligonukleotidov in priprava vzorcev
- določanje čistosti vzorca in začetna NMR karakterizacija
- implementacija NMR metod za meritve dinamike

2. faza:
- meritve dinamike c-MYB G-kvadrupleksa z NMR metodami ter določitev alternativnih konformerov
- sinteza delno s 15N in 13C izotopsko označenih oligonukleotidov
- stabilizacija alternativnih konformerov s kemijskimi modifikacijami in mutacijami
- določanje dinamike stabiliziranih alternativnih konformerov z NMR metodami

3. faza:
- meritve dinamike zvitega telomernega zaporedja in vmesnih stanj z NMR metodami
- stabilizacija alternativnih konformerov s kemijskimi modifikacijami in mutacijami ter določanje njihove dinamike z NMR metodami
- predstavitev rezultatov v revijah z mednarodnim recenzentskim sistemom in na mednarodnih simpozijih in konferencah

4. faza:
- določanje vpliva alternativnih konformerov na vezavo proteinov in multimerizacijo
- predstavitev rezultatov v revijah z mednarodnim recenzentskim sistemom in na mednarodnih simpozijih in konferencah

3. BIBLIOGRAFSKE REFERENCE, KI IZHAJAJO NEPOSREDNO IZ IZVAJANJA PROJEKTA

4. LOGOTIP ARRS IN DRUGIH SOFINANCERJEV

arrs javna agencija za raziskovalno dejavnost